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朝鲜蓟茎叶中脂溶性提取物对神经细胞的保护作用(一)

来源:郑州天顺食品添加剂有限公司 发布时间:2021-09-12 11:17:55 关注: 0 次
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朝鲜蓟为菊科菜蓟属多年生长 木本植物,关键栽植于地中海地区,始于天然的多年生长 的野生型刺菜蓟,是一种含有营养元素的养生蔬菜水果,被觉得是一种功能食品,具备减轻肝胆病及消化不好、抗氧化性、抑菌、防癌等多种多样生理作用活力。朝鲜蓟的可食用部份为內部苞片及花托,不能服用的工业生产副产品一部分包含其外界苞片及叶茎,占全部主茎生物量的80%上下,导致很多的农田占有、資源消耗及空气污染,因而对朝鲜蓟叶茎副产品的综合利用至关重要。

三萜类是异戊二烯高聚物以及化合物的统称,而倍半萜化学物质及三萜化学物质是朝鲜蓟中首要的亲脂质化学物质。Ramos等从刺菜蓟中获取了脂溶性成份并对其成分开展结构化分析,在其中去酰基菜蓟苦素、羽扇豆醇冰醋酸酯、ψ-蒲公英花谷甾醇冰醋酸酯在种植型刺菜蓟中均为第1次报导。有参考文献说明,三萜类具备抗血脂高圈、抗感染嘲、防癌同样生理学活力,殊不知目前为止,对朝鲜蓟副产品中三萜类的综合利用及有关活力的分析较少,针对其神经系统维护功能的消息也是不够。
很多研究表明,氧化应激诱发的神经元损害与多种多样神经系统退行性疾病相关,如阿尔兹海默症和帕金森等。在神经系统退行性疾病中,臭氧造成的氧化应激被普遍以为是神经元细胞损害的首要缘由之一。现广泛认为,对神经中枢系统软件衰退的合理治疗方法是维护神经元免遭空气氧化损害。有大量的科学研究证实,很多纯天然黄酮类物质都具备神经系统维护功效。

本探讨选用GC-MS剖析朝鲜蓟副产品脂溶性提取液中萜类及谷甾醇类物质的构成与成分,根据测量不一样指标值科学研究脂溶性提取液对神经元细胞的保障功效,为朝鲜蓟副产品的开发给予参照。

1 原材料与方式

1.1 原材料与实验试剂

朝鲜蓟的叶茎等副产品于2018年4月份采自于我国云南曲靖市陆良县神经中枢镇华侨农场,采摘后当日马上国际空运送到试验室,液氮冷冻治疗干躁、破碎,过50目筛,装于包装袋中,于-20℃冰柜中储存。

正构乙烷(C7~C40),上海市安普试验科技发展有限责任公司;正十六烷(纯净度>99.5%)、吡啶(纯净度>99.9%),上海市阿拉丁生物化学科技发展有限责任公司;菜蓟苦素(纯净度96.4%)、豆谷甾醇(纯净度98%)、β-谷甾醇(纯净度95%)、羽扇豆醇(纯净度98%),天津市阿尔塔高新科技有限责任公司;α-香环氧树脂醇(纯净度≥98%)、β-香环氧树脂醇(纯净度≥98%)、AnnexinV-FITC细胞凋亡诊断试剂盒,英国Sigma-A1drich企业;三甲基氯硅烷(纯净度>99%)、N,0-双(三羟基硅烷基)三氟乙酰胺(纯净度96%)、二氯甲烷(分析纯级),上海市麦克林生物化学高新科技有限责任公司;30%H202水溶液,国药控股有机化学有限责任公司;RPMll640培养液、青霉素钠-氨苄青霉素、0.25%蛋白酶,英国GIBCO企业;胎牛血清,英国HYCLONE企业;二甲基亚砜(DMSO)、PBS缓冲溶液、DPBS缓冲溶液、CCK8检测试剂盒、DCFH-DA检测试剂盒、吖啶橙-溴化乙锭(A0-EB)检测试剂盒,索莱宝生物技术有限责任公司;脂类空气氧化(MDA)检测试剂盒、乳酸脱氢酶细胞毒性诊断试剂盒,碧云天生物技术性有限责任公司。

1.2 关键仪器设备与机器设备

6890N/5973气象色谱仪-质谱分析液质仪,英国安捷伦科技企业:BDFACSEALIBUR型流式细胞仪,英国BD企业:YG-XD30型光学显微镜,我国PVD企业;Tis型颠倒相差显微镜,日本Nikon企业:InfiniteF50型酶标仪。澳洲TECAN企业。

1.3 脂溶性物质的获取

参照Romas等的办法并稍加改动。精确称量朝鲜蓟副产品干冻粉5g,添加125mL二氯甲烷,索氏提取7h。运用旋转蒸发器在50℃下对萃取液开展低电压干躁,旋蒸后添加二氯甲烷对干躁后的提取液开展复溶,滴定剂至25mL,取1mL氮吹至完全干躁,于-20℃冰柜中储存。

1.4 GC-MS剖析

参照Romas等的办法并稍加改动。在开展GC-MS检验以前,先开展三羟基氯硅烷化(TMS)衍化,向氮吹干躁后的脂溶性提取液中添加250μL含1mg正十六烷(内标)的吡啶,待提取液充分融解后,添加250μL的N,O-双(三羟基硅烷基)-三氟乙酰胺和50μL的三甲基氯硅烷,混合物质于70℃反映30min。

气象色谱仪-质谱分析液质仪配上DB-5J&W毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm,英国安捷伦科技企业),载气为高纯氦气(41cm/s)。色谱仪的使用标准为:自动进样,进样量1μL,气相口溫度270℃,分离比30:1。柱温箱的加热程序流程为:原始溫度120℃,维持2min,以4℃/min的速率升到250℃,然后以2℃/min的速率升到285℃,并维持15min。质谱分析的使用标准为:正离子撞击方式,正离子动能70eV,以全逐行扫描开展数据采集。扫描仪区域为,以30~600,离子源溫度230℃。
GC-MS色谱图的图像处理软件选用MSDChem-Station工作平台(Agilent,VersionE02)。判定时,根据将色谱仪峰的质谱分析信息内容与相关的资料及工作平台所搭配的NIST质谱分析库实现较为,必需时根据标准品判定。定量分析时,关键的萜类及谷甾醇类物质根据标曲定量分析。其他化学物质根据内标(正十六烷)定量分析,結果均换算为试品中化学物质的成分,用mg/kgDM表明。

1.5 细胞培养基

参照Tang等的办法并稍加改动。将PCI2体细胞用完全培养基(RPMI1640培养液,10%胎牛血清,1%青霉素钠-氨苄青霉素)注射于6填料中,注射相对密度3×10五个/mL。接种量2mL/孔,放置37℃,5%CO2的水冷器式CO2孵育箱中塑造24h。

1.6 体细胞魅力的测量

将PCI2体细胞用完全培养基注射于96孔板中,注射相对密度3×10五个/mL,接种量100μL/孔,于37℃,5%C02的孵育箱中塑造24h。用不完全培养基(RPMI1640培养液,2%胎牛血清,1%青霉素钠-氨苄青霉素)将脂溶性提取液稀释液无上、中、低3个不一样的浓度值,各自解决PC12体细胞8h后。添加含90μmol/LH202的不完全培养基塑造4h。与预维护后损害组相对性应,以没经脂溶性提取液维护、经H202损害的PCI2体细胞做为实体模型组,以没经H2O2损害、经浓度较高的脂溶性提取液解决的PCI2体细胞做为脂溶性提取液维护组。以没经其他解决的PC12体细胞做为空白试验组,运用CCK8法检验每孔中体细胞的成活率,参照Ding等圈的方式 ,将解决后的体细胞清除培养液,添加100μL/孔调好的CCK8切削液,放置5%CO2的孵育箱中,37℃孵育2h。酶标仪检验橘黄甲臌的总产量。检验光波长450nm处的OD值值,每一组做6个平行面。

1.7 乳酸脱氢酶(LDH)露出率检验

细胞培养基中的LDH成分是考量体细胞受损水平的主要指标值,对依照1.5节方式塑造好的体细胞开展4组不一样解决后,搜集每孔中的培养液,依照检测试剂盒使用说明检验培养液中LDH活力。

1.8 抗氧化性活力的测量

氧化应激会立即或间接性造成 ROS受体的核苷酸、蛋白和脂类损害,而且涉及到病变圜、神经系统退行性改变幽、主动脉粥样硬化、糖尿病患者圆和变老陶等。在神经系统退行性疾病中,臭氧(ROS)造成的氧化应激被普遍以为是神经元细胞损害的首要缘由之一,本科学研究运用2’,7’-二氯荧光黄双甲酸盐(DCFH-DA)探头检验体细胞内ROS水准。对依照1.5节方式塑造好的体细胞开展脂溶性提取液解决组、实体模型组、空白试验组3组解决后,用没有乙二胺四乙酸(EDTA)的蛋白酶消化吸收体细胞,于4℃,1500r/min离心式3min后应用完全培养基清洗体细胞,依照1:1000占比用无血清蛋白培养液(RPMll640培养液,1%青霉素钠-氨苄青霉素)稀释液DCFH-DA。取0.5mL封闭液添加体细胞,于CO2孵育箱中遮光孵育20min,应用无血清蛋白培养液清洗体细胞3次,用光学显微镜观查体细胞莹光状况,并且用流式细胞仪量化分析检验。检验标准为激起光波长488nm。发送光波长605nm。对依照1.5节方式塑造好的体细胞开展4组解决后,依照检测试剂盒使用说明对人体细胞内丙二醛(MDA)水准开展检验,来明确脂类空气氧化的水准。

1.9 细胞坏死的测量

对依照1.5节方式塑造好的体细胞开展预维护后损害组、实体模型组、空白试验组3组解决后,用没有EDTA的蛋白酶消化吸收搜集体细胞。杜氏磷酸缓冲液(DPBS)清洗体细胞2次,添加500μL双蒸水稀释液好的融合缓冲溶液(1×)重悬体细胞,上机操作前添加5μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)和10μL碘化丙啶(PI),室内温度遮光反映10min,体细胞流式的仪量化分析检验,检验标准为激起光波长488nm,发送光波长530nm。对依照1.5节方式塑造好的体细胞开展预维护后损害组、实体模型组、空白试验组3组解决后,向每一个体细胞解决组的培养液中添加40μLA0-EB染色液,室内温度置放5min,光学显微镜照相观查。

申明:文中常用照片、文本来源于《中国食品学报》,著作权归原作全部。

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