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吡咯喹啉醌产生菌的筛选和菌种鉴定(一)

来源:郑州天顺食品添加剂有限公司 发布时间:2021-09-12 10:54:37 关注: 0 次
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为了更好地挑选造成吡咯喹啉醌,英语名叫pyrroloquinoline quinone(PQQ)的菌种并提升 PQQ发醇生产量,该科学研究创建了一种迅速的高效液相色谱色谱分析检验PQQ,并选用了以工业甲醇为唯一氮源的可选择性培养液,运用光谱法对试品开展初筛,高效液相色谱色谱分析(HPLC)对初筛获得的最后再开展复筛。该分析还对挑选获得的菌种发醇产PQQ的培养液开展了提升。科学研究数据显示:从试品中挑选得56株PQQ造成菌,摇瓶生产量最大的一株为20.6 mg /L,根据16s rDNA 转录组测序剖析,评定该菌种为Methylopila sp.属。对培养液成份中的氮源工业甲醇开展了提升科学研究,当工业甲醇容积含量为2.5%时,PQQ生产量最大,为26.3 mg /L,对比于原始工业甲醇1.0%提升 了28%。该科学研究创建的高效液相色谱色谱分析为PQQ增产菌种的挑选给予一种快速检测方式,挑选到的菌种具备较高的工业甲醇耐受性和PQQ利用效率,为以后的PQQ发醇科学研究给予参照。

吡咯喹啉醌,英语名叫pyrroloquinoline quinone(PQQ),做为很多病菌脱氨酶(工业甲醇脱氨酶,乙醇脱氢酶和葡萄糖水脱氨酶等)的第二信使于1964年初次被发觉,它是继吡啶多肽链和维生素b2以后的第三种空气氧化还原酶的辅酶。PQQ在自然界的遍布极其普遍,在动物与植物和细菌体细胞中都发觉其存有,但仅有一部分革兰氏阳性菌呈阴性病菌能生成PQQ。

在具备生成PQQ工作能力的病菌中,绝大多数只有生成痕量元素的PQQ以提供细胞生长,仅有一小部分能够生产制造过多的PQQ,并将其代谢到培养液中,在其中以甲基营养菌的生成能力最强,如羟基菌属(Methylobacill),羟基单胞菌属(Methylomonas),嗜羟基菌属(Methylophilus)和羟基杆菌属(Methylobacterium)等。除此之外,在纳豆激酶,辣椒和奇异果等绿色植物身体也带有少量的PQQ,而且牛乳和人们的奶水中也存有较浓度较高的的PQQ。近几十年来的研究发现PQQ具备各种生理作用,它是很多病菌脱氨酶的第二信使,参加人体细胞的电子器件呼吸链传送;PQQ能够提升 微生物菌种体细胞的抗旱性,并提升 寄主菌的抗氧化能力[18];PQQ或是动物与植物刺激性或细胞生长因子;除此之外,PQQ与葡萄糖水脱氨酶融合产生PQQ-GDH全酶,可作为检验葡萄糖水的生物传感器,也可用于微生物氢燃料电池。

因为现阶段PQQ有机合成流程繁杂,副产品多,而生物发酵生产制造PQQ低成本,流程少,物质分离出来更非常容易,因而生物发酵法变成最有发展前景的工业生产线路。尽管对PQQ的探讨已经有几十年,但其微生物生成的主要全过程并未充分表明,从自然环境中挑选增产野山菌仍然是不可或缺的。1992年,URAKAMI等挑选到一株PQQ造成菌,经评定为生丝微菌Hyphomicrobium sp.TK0441,提升培养液后在30 L发酵设备上发醇14天后PQQ生产量可做到1 g/L。司振军等[22]从土质中挑选到一株甲基营养菌,经评定为Methylobacillus sp.zju323,没经提升的PQQ摇瓶生产量为23.2 mg/L,在已报导的分析中归属于高质量。本科学研究创建了一种高效液相色谱色谱分析用于快速检测PQQ,并从土壤层试品中筛分获得一株PQQ增产菌,并对其完成了菌种鉴定和培养液提升,为事后开展PQQ的进一步生产制造科学研究给予根据。

1原材料与方式

1.1原材料与实验试剂

病菌试品来自于无锡市生产制造工业甲醇加工厂周边的土质和废水。PQQ标准物质购自于Sigma企业,别的实验试剂均购自于国药控股。

1.2仪器设备与机器设备

G180T灭菌锅,英国致微仪器设备有限责任公司;快速冷冻离心机,英国赛默飞世尔科技有限公司;酶标仪,英国BioTek企业;Agilent-1260高效率液相色谱,英国安捷伦科技企业。

1.3培养液

挑选培养液:工业甲醇30 mg /L,(NH4)2SO4 3 g/L,Na2HPO4·12H2O 3 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L ,KH2PO4 1.4 g/L,营养元素液 1 mL/L。固体培养基加上2%的琼脂粉。

种籽培养液:工业甲醇10 mg /L,(NH4)2SO4 3 g/L,Na2HPO4·12H2O 3 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,KH2PO4 1.4 g/L,营养元素液 1 mL/L。营养元素液:CaCl2·2H2O 30 mg/L,MnCl4·4H2O 5 mg/L发醇培养液:在种籽培养液的根基上添加1 mL维他命液,维他命液秘方(mg/L):维生素b2200,对羟基苯甲醛200,盐酸硫胺素400,维生素b3400,盐酸吡哆醇400,泛酸钙400,叶酸片2,生物素2,肌醇2000。

1.4实验方法

1.4.1 PQQ造成菌初筛方式的建立

光谱法:对PQQ标准物质开展全光波长扫描仪,发觉其在249 nm和330 nm处有两个消化吸收峰,将200 μ L PQQ标准物质水溶液或发醇离心式上清液迁移至96孔板中,用酶标仪检验 OD330与 OD249,并将空缺培养液以相同的标准解决和检验,进而减掉培养液吸光度值的影响。

1.4.2 HPLC法检验PQQ

因为PQQ的构造上接有3个—COOH,因而其可溶强电解质,旋光性很大,在平常的C18反相离子交换柱上不保存。现阶段使用较多的是离子色谱仪对法来检验PQQ,可是离子色谱仪对均衡时间长,实际操作繁杂且对柱头也是有局限;也有选用电解硫酸铜调整pH来使PQQ保存在离子交换柱上,但这促使峰形托尾比较严重而且再现性不太好。因此本试验挑选亲水性离子交换柱来处理PQQ无法在离子交换柱上保存的难题。以水为流动性相,根据COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ正相反离子交换柱,测量PQQ在249 nm和330 nm的吸光度值,依据出峰总面积明确其浓度值。运用安捷伦1260系列产品高效率液相色谱测量PQQ成分,进样量20 μ L,溫度30 ℃,流动性相为0.05 mol/L甲酸:0.05 mol/L乙酸铵=30:70,流动速度1 mL/min,在光波长249 nm和330 nm下检验PQQ标准物质和试品成分。

1.4.3菌种的挑选

将试样做成适度浓度梯度的封闭液,施胶于工业甲醇挑选培养液平板电脑上,30 ℃塑造3~5天,各自挑菌不一样状态的单菌体注射到种籽培养液中,30 ℃,200 r/min 塑造3~5天,将发酵物离心式取上清液,用光谱法快速检测PQQ成分,再用HPLC法对PQQ生产量较高的菌种开展复筛。

1.4.4菌苗的评定

将PQQ生产量最大的菌种在固体培养基上划线,30 ℃塑造3~5天,运用一般显微镜观查菌体形状特点。取单菌体注射到摇瓶培养液中,30 ℃塑造,当菌体OD600为0.5~1时,取3 mL发酵物,10000 r/min离心式1 min,弃去上清液,搜集菌体,依照病菌基因DNA获取检测试剂盒(TIANGEN企业)获取DNA,运用病菌通用引物 27F:5'-AGA GTT TGA TCM TGGCTC AG -3';1492R:5' -GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3',根据 PCR 反映增加该菌种的16s rDNA序列,将物质授权委托上海生工转录组测序,将DNA测序結果在NCBI网址中开展BLAST核对,用手机软件MEGA开展系统软件进化树的搭建。

1.4.5工业甲醇成分对菌体生长发育和PQQ生产量的危害

对培养液中的唯一氮源工业甲醇开展提升,科学研究工业甲醇的差异加上容积浓度值(0.5%,1%,1.5%,2%,2.5%,3%,3.5%,4%)对菌体生长发育和PQQ生产量的危害。

2結果与剖析

2.1光谱法检验PQQ

科学研究创建了根据光谱法检验PQQ的迅速挑选方式,根据全光波长扫描仪发觉PQQ在249 nm和330 nm上下有两个消化吸收峰。充分考虑发酵物中带有蛋白质,核苷酸等在249 nm上下有消化吸收值的化学物质,而在330 nm上有消化吸收值的成分较少,因而,本试验挑选科学研究PQQ浓度值和OD330的关联。根据酶标仪检验不一样浓度值 PQQ标准物质的OD330(检验试样时要减掉空缺发醇培养液的吸光度值以去除影响),发觉在330 nm下PQQ浓度值与OD330关联为y=0.0218x-0.0354 (R2=0.9957)。当PQQ浓度值在2.5~50 mg/L中间时,二者展现较好的线性相关,因为野山菌产PQQ量多在1~20 mg/L上下,因而应用本方式开展高通量筛选的初筛具备优良的可行性分析。

申明:文中常用照片、文本来源于《食品与发酵工业》,著作权归原作全部。

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