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蛋清溶菌酶的提取及其酶学性质探究(三)

来源:郑州天顺食品添加剂有限公司 发布时间:2021-09-12 09:33:05 关注: 0 次
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2.3 超滤膜纯化标准可靠性设计

将以上提升标准制取酶液做进一步超滤膜纯化提升,将酶液放置截流量为50ku的超滤离心管中,于4000~6000×g,离心式5~15min,去除杂蛋白质,弃去离心管架顶层液。再将下一层液放置截流量为3ku的超滤离心管中,于6500×g,离心式20min,保存顶层截流液,测量其酶成分及比魅力,結果如表5所显示。得知,伴随着转数的上升,酶成分逐步上升,而溶菌酶比魅力呈先升高后降低的发展趋势,推断因为离心式转速比过低促使溶菌酶被一部分截流在顶层,而离心式转速比过高,虽能将溶菌酶所有通过下一层,但一部分杂蛋白质不可以有效的除去,一样不被截流,或者溶菌酶在快速离心式历程中有一定的损害,致酶魅力降低。且伴随着离心式時间增加,比魅力有所增加,殊不知离心式時间不适合太长,太长的离心式時间会使工作效率减少,不利大规模生产。故当溶菌酶比魅力为最高值时,挑选50ku超滤离心管,在5000×g标准下离心式10min。

2.4 溶菌酶纯净度检测

将最佳阳离子交换所得的的过柱液与最佳的超渗沥液各自抽样开展SDS-PAGE凝胶电泳实验,电泳原理結果如图所示8和图9所显示。

由图8、图9比照得知,过柱液和超渗沥液均可在14.4ku看到显著杂带,与鸡蛋清溶菌酶的相对性分子质量相符合。除此之外,只历经阳离子交换的过柱液的杂蛋白质及残渣盐较多,危害纯净度,而过柱液历经二步超滤膜后,杂蛋白质、残渣盐较少,获取的溶菌酶纯净度较高。

采用历经阳离子交换协作二步超滤膜法纯化的鸡蛋清溶菌酶液,测量溶菌酶的纯净度,結果如图所示10所示,并且用ImageLab5.2.1手机软件对图片开展剖析,所得的数据信息如表6所显示。

由表6得知,超渗沥液中蛋白质分子品质在14.4~15.1ku,合乎鸡蛋清溶菌酶分子质量的划分范畴。除泳道4外,其他泳道均值为2290619,蛋白标准物质的第六杂带(溶菌酶杂带)成分为0.125μg/μL,上样量为5μL,相对性浓度值数值619080,实验测出超渗沥液中蛋白质含量为2.40μg/μL,上样量10μL(上样缓冲溶液∶试品(容积比)=4∶1),相对性浓度值数值2290619,故估计得溶菌酶纯净度为96.36%,测出该溶菌酶的比魅力为23718.61U/mg。

2.5 溶菌酶的酶学特性研究

2.5.1 pH值对溶菌酶酶活的危害

由图11得知,随pH值的持续上升,溶菌酶的相对性酶活呈先升高后降低的发展趋势,溶菌酶在pH5~8均可维持85%之上的相对性酶活,在pH数值3~4时仍有70%之上的相对性酶活,在pH数值7.0时,酶魅力做到最高值,可推断,溶菌酶的适宜pH值约为7.0。pH值危害溶菌酶酶活的因素可能是因为pH值的更改对底物溶壁微革兰阴性杆菌的情况造成危害,也可能是pH值促使酶的通电情况更改,进而危害酶的活性。

2.5.2 溫度对溶菌酶酶活的危害

由图12得知,在20~60℃时,溶菌酶相对性酶活随环境温度上升迟缓升高,且相对性酶活均在78%之上,溫度功效覆盖面广;在60℃时,酶活做到最大值,若再次提温,则酶活降低较快。其很有可能是由于超低温时随气温升高分子热运动加速,提升 了反应速率,而当气温抵达60℃后,随反映溫度的上升,鸡蛋清溶菌酶慢慢降解,促使酶促反应降低。

2.5.3 溶菌酶的pH可靠性

由图13得知,溶菌酶在呈酸性及中性化的条件下相对稳定,在pH4.0~7.0的范畴内,相对性酶活维持在88%之上。而在偏碱自然环境下,伴随着時间增加,相对性酶活慢慢降低,且随pH值上升,变化幅度越来越大,在pH8.0的盐水中解决90min,酶魅力降为原始的80%,而在pH9.0的盐水中解决90min,酶魅力降为原始的65%。故溶菌酶在偏酸碱性及中性化情况下比较平稳,经过酸、过碱易使其降解,这与傅婷等的分析結果相近,可能是因为溶菌酶在酸碱性自然环境中为碳链构像随酸值转变 危害并不大,构造相对稳定。

2.5.4 溶菌酶的溫度可靠性

由图14得知,在30~60℃时,溫度对酶活危害并不大,溶菌酶维持较高可靠性;在70℃隔热保温一段时间,酶活迟缓降低,90min后,比魅力减少为初值的78%;而在80℃隔热保温一段时间,酶活降低速度较高,90min后,比魅力降为初值的52%。可能是随环境温度上升,溶菌酶转性降解水平上升,降解速率加速。

2.5.5 金属离子对溶菌酶酶活的危害

由图15得知,Na 、Ca2 对溶菌酶有极强的激话功效;K 对溶菌酶激话功效较差;而Zn2 对溶菌酶活力有极强的抑制效果;其他金属离子(Mg2 、Mn2 )对溶菌酶活力无显著危害。故除少数离子对溶菌酶活力有抑制效果外,绝大多数金属离子对酶活不容易造成干扰或具有激发功效,即绝大多数金属离子与溶菌酶具备优良的搭配功效。

2.5.6 表活剂对溶菌酶酶活的危害

由图16得知,几类表活剂对鸡蛋清溶菌酶活力都是有一定的抑制效果,在其中Tween20、Tween40、Tween80对酶魅力危害较小,相对性酶魅力维持在84%之上,而历经摩尔分数10%的凡士林解决的溶菌酶相对性酶魅力降到78%。这很有可能与表活剂对溶菌酶构造造成危害相关;表活剂的高粘度特点会减少溶菌酶的活力,因此在溶菌酶制取环节中应降低或不应用表活剂。

3 结果

文中对阳离子交换协作超滤技术获取鸡蛋清中溶菌酶的技术完成提升,并对溶菌酶的纯净度和一部分酶学特性开展研究,关键依据如下所示:

1)根据单要素和Box-Behnken实验获得最佳获取加工工艺标准为:环氧树脂使用量为鸡蛋清渗沥液容积为24.2%,过柱液为1.00mol/LNaCl,鸡蛋清渗沥液pH数值9.10,过柱時间为62.61min,这时基础理论预测分析酶液的比魅力为21041.1U/mg。对所获取的技术标准开展认证获得具体酶液的比魅力为20509.58U/mg。将提升后的酶液开展超滤膜提升,并开展SDS-PAGE纯净度评定,所得的二步超滤膜标准为:应用50ku超滤膜,在5000×g标准下离心式10min,再用3ku超滤膜,6000×g离心式20min,最后测得溶菌酶的比魅力为23718.61U/mg,纯净度为96.36%。

2)根据对溶菌酶的酶学特性的分析得知,溶菌酶适宜pH数值7.0,pH值在4.0~7.0范畴内可靠性不错;适宜反映溫度为60℃,超低温下耐热性优良,在较高溫度下酶活降低较快;Na 、Ca2 对酶有较强激话功效,K 有一定激话功效,Mg2 、Mn2 对酶活危害并不大,Zn2 对酶有显著抑制效果;表活剂凡士林、Tween20、Tween40、Tween80均对溶菌酶有抑制效果,凡士林的抑制效果较强。

文中根据单要素及响应面法提升阳离子交换-超滤膜法协作获取鸡蛋清中溶菌酶最好的技术标准,并对所获取溶菌酶的酶学特性开展研究,为下一步现代化及产业化生产制造打下基础。

申明:文中常用照片、文本来源于《中国食品报》,著作权归原作全部。

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