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基于碘化钾-淀粉显色光度法测定过氧化氢酶活性(二)

来源:郑州天顺食品添加剂有限公司 发布时间:2021-09-12 09:27:50 关注: 0 次
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5、显色反应時间危害

取50ml容量瓶一只,添加CAT样液(酶促反应低于2U/mL)1.00mE、H202栽培基质液2.00mL,25℃水浴反映30min后马上添加1.5mL盐酸停止反映,加碘酸钾5mL,60℃水浴加热40min,制冷,加木薯淀粉3mL,滴定剂,以纯净水作参比液,在光波长600nm处测OD值A,与此同时进行酶试剂空白OD值A0测量,依据△A(△A=A0一A)明确过氧化氢酶活力E。其他情况不会改变,只更改反应速度,测量5~70min内A值(图3)。30min内OD值与時间有线性相关。不难看出,H2O2空气氧化KI具备零级反应的特性,生成物初始浓度值立即影响了反应速率,40min后反映彻底。因此显色反应時间确认为40min。

6、酶促反应時间危害

取过氧化氢酶切削液10.00mL作检测液,其他情况不会改变,更改酶促反应時间,测量△Ao以時间t为横坐标轴,△A为纵轴作酶促反应曲线图。由图4得知:在反映原始环节的0~30min内,In△A与时长正相关,合乎酶促催化反应一级反应特点。30min后,△A趋向稳定。因而,明确酶促反应時间为30min。

7、工作中曲线图

取过氧化氢酶标液0.00—20.00mL作检测液,在最好情况下进行△A测量,制作工作中曲线图(图5)。过氧化氢酶魅力E(U/mL)在0.002~0.04U/mL范畴内与△A呈优良的线性相关:△A=0.06843 16.9866E(U/mL),r=0.9970。按实验方法平行测定空缺10次,相对标准偏差s为0.01,检出限为0.0018U/mL,最少检测量做到0.15U。

8、影响实验

取10.00mL过氧化氢酶标液作检测液,依照实验方式调查生物组织并存氧化性化学物质影响状况。結果发觉,2倍于基底液浓度值的葡萄糖水、葡萄糖、乳清蛋白、半乳糖不危害酶比活度测量,数据误差低于5%。

9、试品剖析

H2O2是蛋白质食物细胞的新陈代谢正中间物质,因此肝部中有着较多的CAT,试验选择鱼肝部CAT萃取液做剖析。将购买鲜鱼杀掉,脱离肝部,用过滤纸吸走,秤重,按1:10(w/V)添加1~4℃冷0.25mol/L绵白糖液,匀浆,1500r/min下离心式5min,取上清液,用0.25mol/L绵白糖稀释液50倍,制取酶粗液,1~4℃自然环境中储存。取酶粗液1.00mL进行活力测量,平行面六次,测算均值和相对性相对标准偏差,测算利用率。

利用率操纵在96%~105%范畴内,表明粗酶液并存化学物质不危害酶促反应测量;依据测量結果可计算出来鱼肝CAT成分各自为550U/g(鲫鱼)和537U/g(鲤鱼)。

申明:文中常用照片、文本来源于《中国食品添加剂》,著作权归原作全部。

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