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甘蓝型油菜乙酰转移酶基因的克隆及功能验证(一)

来源:郑州天顺食品添加剂有限公司 发布时间:2021-09-12 09:27:24 关注: 0 次
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伴随着大家生活水平的提升和对食品类营养健康作用了解的提升,在我国食品油的需求量持续提升,油菜子是中国主要的燃料和农作物之一,食用油不但含有身体所必要的碳水化合物和油酸,并且能长时间地存储,为了更好地更好的达到众多群众对高品质食品油的要求,食用油质量改进已成为了当今油菜子繁育行业的网络热点。

食用油的主要成分是油酸,植物油脂的好坏由油酸决策,而植物油脂油酸的优劣则首要在于其碳氢化合物链饱和状态水平。油酸依据碳氢化合物链饱和状态与不饱和脂肪分成3类:饱和脂肪(关键有豆蔻酸、聚醚等)、单不饱和脂肪(脂肪酸、芥酸等)和多不饱和脂肪(脂肪酸、a亚麻酸等),有研究表明,预防糖尿病的基本方针集中化在将膳食中的饱和脂肪酸和反式脂肪酸变化为不饱和脂肪酸,饱和脂肪溶点较高,易凝结在微血管内壁,进而造成 血压高和主动脉粥样硬化,且饱和脂肪还造成 血碳水化合物浓度值升高,不饱和脂肪溶点较低,非常容易被身体消化吸收。

本分析以湖南稻谷油菜子抗病性重点实验室早期对高a亚麻酸甘蓝型油菜子(Brassicanapus)近等遗传基因系开展的miRNA转录组测序結果为基本,挑选到的与油酸新陈代谢有关的bna-miR396以及靶遗传基因乙酰转移酶遗传基因(Acetyltransferasegene,AT)。研究表明,AT根据催化反应酰胺基团从乙酰辅酶A(乙酰CoA,AcetylCoA)迁移到其功效底物芳香胺及杂环化合物丙烯胺化学物质上,参加油酸转换与溶解,AT缺少会延迟绿色植物盛开時间并减少育性。运用同源基因复制,获得AT遗传基因的两个复制,各自搭建过表达载体与影响媒介,转换拟南芥,剖析转基因水稻拟南芥子孙后代种籽油酸构成,研究该遗传基因在油酸生成流程的作用,以求推动甘蓝型油菜子人体脂肪生成分子结构原理科学研究。

1 原材料和方式

1.1 实验原材料

高a亚麻酸甘蓝型油菜子近等遗传基因系(低a亚麻酸株系575,a亚麻酸成分为5.1%;高a亚麻酸株系574,a亚麻酸成分9.8%),野生型拟南芥(WT)由湖南省农业大学我国燃料改进核心给予。大肠埃希菌感受态DH5α,约束性内切酶、dNTP、T4DNALigationKit购自北京市擎科生物高新科技有限责任公司;pMD18-T媒介由本试验室储存;pCambia1300-35s-N1、pCambia1300-RNAi媒介购于上海市康颜生物技术有限责任公司;本实验中使用到的引物设计均由北京市擎科生成。

1.2 AT分子克隆

运用数据库查询实现查找,发觉AT遗传基因有两个复制,各自在A基因和C基因,并为此编码序列(GSBRNA2T00114025001、GSBRNA2T00148464001)开展事后引物设计(表1),在其中5′端酶切位点前的编码序列用以资产重组联接。

选用TransZolUP绿色植物总RNA获取检测试剂盒(北京市全式金)获取低a亚麻酸甘蓝型油菜子株系575自交受粉后20~35d混和种籽总RNA,并且用TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix反转录检测试剂盒(北京市全式金)生成cDNA第一链,为此为模版,开展PCR扩增,增加管理体系包括KOD-FX聚合酶1μL,2×PCRBuffer25μL,dNTP(2.5μmol/L)10μL,正反面向引物设计各0.2μmol/L,cDNA低于500ng,用ddH2O补充至50μL。反映情况为98℃2min预转性;98℃10s,60℃30s,68℃2min,3五个循环系统;68℃7min拓宽。

经PCR提纯回收利用后,与pMD18-T媒介相接,转换到大肠埃希菌中,由北京市擎科企业开展转录组测序。

1.3 生物信息学剖析

用SnapGene3.2.1将复制到的靶基因序列译成碳水化合物,经NCBI数据库查询BlastP开展评定后,预测分析相匹配蛋白质的一级结构,包含碳水化合物构成、理化性质等;各自登陆PredictProtein、SOPMATMHMM网址开展蛋白质亚细胞定位预测分析、构造预测分析、跨膜螺旋式区剖析;根据SWISS-MQPEL搭建蛋白质三级结构模型。

1.5 过表达载体与RNAi影响载体构建

用BamHI和SalI双酶切pCambia1300-35s-N1媒介,胶回收利用,物质开展身体之外同源重组反映,得到重组质粒。

用XbaI及BamHI双酶切pCambial300-RNAi媒介及其每个遗传基因的RNAi精彩片段的PCR物质,具体做法参照刘晓等,并做好改善,胶回收利用后开展联接,得到重组质粒。转录组测序检测恰当后,用PstI和Sal.I双酶切重组质粒及每个遗传基因的RNAi精彩片段的PCR物质,再度开展联接,转换,得到最后的RNAi媒介。

将搭建好的过表达载体与RNAi影响媒介转到农杆菌中,以野生型拟南芥为蛋白激酶,开展遗传基因转换,得到T0种籽;用潮霉素挑选T0拟南芥呈阳性苗并栽种,以后,用PCR评定转基因水稻苗,扣除获得T1种籽。

1.6 油酸成份测量

选用SP-6890型气相色谱、FID探测器、N3000色谱仪工作平台、毛细血管离子交换柱DB-23对转基因水稻拟南芥T1种籽开展油酸成份测量,对七个关键的油酸成份开展剖析,测量时取五个转基因水稻子孙后代株系,每一个产品检测约30粒种籽。

2 結果与剖析

2.1 靶遗传基因与特异性影响精彩片段复制及检验結果

以低a亚麻酸甘蓝型油菜子20~35d自交种cDNA为模版,高保真音响增加了乙酰转移酶遗传基因的两个复制,尺寸均为1350bp。各自对两个靶遗传基因特异性精彩片段开展PCR高保真音响增加,获得了目地精彩片段长短尺寸的DNA片段。

2.2 生物信息学剖析

2.2.1 蛋白一级结构预测分析与剖析

以SnapGene3.2.一分别对AT遗传基因汉语翻译下来的氨基酸序列,根据ExPASy-ProtParamtool开展理化性质分析表明(表3),AT遗传基因的两个复制114与148碳水化合物均为449个,相对分子质量约50.5ku,114编号的碳水化合物偏中性化而148编号的蛋白质偏偏碱。不稳定指数表明114与148均为平稳蛋白质,且吸水性较弱,归属于脂溶性蛋白质。

申明:文中常用照片、文本来源于《华北农学报》,著作权归原作全部。

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