郑州天顺食品添加剂有限公司

郑州天顺食品添加剂有限公司是一家从事生产批...

全国服务热线 15003810456
您所在的位置:

农药残留的酶活性抑制与免疫分析技术的免疫分析法(十)

来源:郑州天顺食品添加剂有限公司 发布时间:2021-09-12 09:22:02 关注: 0 次
标签: , ,

(5)杂交瘤细胞塑造与抗原的分离出来取挑选出的呈阳性杂交瘤体细胞在CO2恒温箱中开展离体塑造,从细胞培养液中分离出来单抗。或采用BALB/c小白鼠或其等位基因小白鼠,首先用4-羟基十五烷或液体石蜡开展腹部注入,1星期过后将杂交瘤细胞注射到小白鼠腹部中。注射1星期过后搜集小白鼠的肝腹水,分离出来肝腹水中的单抗。

3、抗原提纯单抗的提纯方式与多克隆抗体的提纯方式相近。现阶段最有效的单抗的提纯方式是免疫力亲和力色谱分析,该法将链球菌A蛋白质或抗小白鼠人免疫球蛋白与适度媒介(最常见的是Sepharose)化学交联,制取免疫力亲和力离子交换柱,将抗原融合后过柱,利用率可以达到90%之上。

(四)标识物的制取与提纯

半抗原、抗原和抗体的标识依据选定的标识免疫力统计分析方法不一样,采用不一样的标识物。如酶联免疫吸咐测定方法(ELISA)常见的标识物有辣根乳酸脱氢酶(horseradish Deroxidase,HRP)、偏碱磷酸酯酶(alkaline phosptlatase,AP)等,流动性注入免疫力剖析(FIIA)常见的标识有鲁米诺等,(ABS)系统软件常用的标识物为生物素,金标免疫力剖析使用的标识物为纳米金。

1、半抗原的标识与提纯

半抗原的标识依标识物的类别和半抗原的活力官能团不一样使用不一样标识方式。如用辣根乳酸脱氢酶标识含分散羟基的半抗原,一般 选用碳二亚胺法、活力酯法或混和酸酐法。用辣根乳酸脱氢酶标识带有分散羟基的半抗原可选用戊二醛法、二异硫氰酸酯法等。必须特别注意的是,辣根乳酸脱氢酶催化反应氯丁二烯释放出来臭氧,一些物理性质不足平稳、非常容易被氧化的半抗原(如酚类等)在与辣根乳酸脱氢酶共价键耦联的历程中需要留意遮光避氧,避免 半抗原被氧化后造成 相对应抗原无法识别。

酶标半抗原的提纯可选用分析、超滤膜离心分离。小分子标记物标识的半抗原可选用薄层色谱、柱色谱分析分离纯化。

2、抗原体的标识与提纯

抗原体的标识视抗原体的类别和性能而定。在化肥免疫力剖析中,常用的抗原体是人造的(半抗原与载体蛋白的耦联物),因而标识物能够标识在人力抗原体的载体蛋白上。蛋白类抗原体的标识、提纯,与抗原的标识、提纯方式相近。

3、抗原的标识与提纯

抗原的标识依据标识物的差异使用不一样的标注方式。辣根乳酸脱氢酶标识抗原常选用改进的过碘酸盐法,将要辣根乳酸脱氢酶分子结构中糖的醇羟基空气氧化成醛基后与抗原的分散羟基共价键耦联。分子结构中含分散羧基(如生物素等)、分散羟基的标识物(如辣根乳酸脱氢酶)与抗原的耦联方式类似含分散羧基、羟基的半抗原与载体蛋白的共价键耦联。含脂环伯胺的标识物,选用重氮化法与抗原分子结构中色氨酸残基的酚羟基邻位产生甲酰胺键连接。含丙烯酸酯构造的标识物可与抗原的分散羟基立即耦联。为避免 标识物耦联在抗原的抗原体相接处而造成 抗原的病毒学活力减少,可选用马来酰亚胺类活力酯等办法将标识物与多肽链抗原的巯基共价键联接,由于抗原的抗原体相接处没有巯基。纳米金标识抗原则选用物理学粘附法。

因为标识物的分子大小不一样,标识抗原的提纯方式也不一样。如标识物为小分子水化学物质,标识抗原的提纯可选用分析、离心式超滤膜法。若标识物为生物大分子(如辣根乳酸脱氢酶),标识抗原的提纯一般选用Sephadex疑胶柱色谱分析。如用小分子标记物标识半抗原,可选用薄层色谱、硅橡胶柱色谱分析分离纯化。

(五)免疫力剖析新技术的确立与标准提升

1、抗原和抗体的浓度值挑选

抗原和抗体反映中,抗原的浓度值需与抗原体浓度值相一致,一般 选用矩阵测验法挑选抗原和抗体的最佳浓度值组成。

(1)间接性市场竞争酶联免疫吸咐测定方法中被子原和抗原浓度值的挑选,针对问接市场竞争酶联免疫吸咐测定方法,被子原和抗原浓度值的选用流程如下所示。

①被子:将被子原用pH 9.6的硫化物缓冲溶液倍比稀释液成一定的浓度值系列产品,100μL/孔,被子酶标板不一样的行,空白试验孔加等容积缓冲溶液,4℃下吸咐留宿。

②封闭式:次日倾去被子液,清洗除去分散物,加封闭液150μL/孔,37℃下封闭式1.5 h。清洗除去分散物。

③反映:将抗原用适度pH的聚磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer,PB)倍比稀释液至一定浓度值系列产品添加酶标板的不一样列,100μL/孔,37℃下反映1~1.5 h。清洗除去分散物。

④加酶标二抗:将酶标二抗稀释液至工作中浓度值,加至酶标板,100μL/TL,37℃下反映1~1.5 h。清洗除去分散物。

⑤着色测量:加底物与铬黑T溶液100μL/孔,37℃下遮光反映15 min。加50μL/孔终止剂停止反映,在酶标仪上测量各孔的吸光度值。

各自以被子原浓度值和抗原浓度值为横坐标轴、以吸光度数值纵轴做图。挑选吸光度值约为1.0抗原和抗体浓度值都较低、处在吸光度曲线图转折点处的抗原和抗体浓度值为适宜浓度值组成。

(2)包被抗原立即市场竞争酶联免疫吸咐测定方法中被子原和酶标抗原浓度值的选取在包被抗原立即市场竞争酶联免疫吸咐测定方法中,被子原和酶标抗原浓度值的选用流程如下所示。

①被子:将被子原用pH 9.6的硫化物缓冲溶液倍比稀释液成一定的浓度值系列产品,被子酶标板的不一样行,100μL/TL,空白试验孔加等容积缓冲溶液,4℃下吸咐留宿。

⑦封闭式:次日倾去被子液,清洗除去分散物,加封闭液150μL/TL,37℃下封闭式1.5 h。清洗除去分散物。

③反映:将酶标抗原倍比稀释液成工作中浓度值系列产品,加至酶标板的不一样列,100μL/孔,37℃下反映1~1.5h。清洗除去分散物。

④着色测量:加底物与铬黑T溶液100μL/孔,37℃下遮光反映15min,加终止剂50μL/孔停止反映,在酶标仪上测量各孔的吸光度值。

各自以被子原浓度值和酶标抗原浓度值为横坐标轴、以吸光度数值纵轴做图。挑选吸光度值约为1.0处在吸光度曲线图转折点处的被子原和酶标抗原浓度值为适宜浓度值组成。

(3)被子抗原立即市场竞争酶联免疫吸咐测定方法中抗原和酶标半抗原浓度值的选取在被子抗原立即市场竞争酶联免疫吸咐测定方法中,抗原和酶标半抗原浓度值的选用流程如下所示。

①被子:将抗原用适度pH的聚磷酸盐缓冲溶液倍比稀释液成一定的浓度值系列产品并被子酶标板的不一样行,100μL/TL,空白试验孔加等容积聚磷酸盐缓冲溶液,4℃下吸咐留宿。

②封闭式:次日倾去被子液,清洗除去分散物,加封闭液150 μL/TL,37℃下封闭式1.5 h。清洗除去分散物。

③反映:将酶标半抗原用磷酸缓冲溶液倍比稀释液成一定浓度值系列产品并加至酶标板的不一样列,100μL/TL,37℃下反映1~1.5 h。清洗除去分散物。

参考文献:农残剖析,

feihu分享到:

      

文章版权备注

文章版权归 郑州天顺食品添加剂有限公司 所有
文章链接:https://www.zztjj.cn/6292.html
未经授权,禁止任何站点镜像、采集、或复制本站内容,违者通过法律途径维权到底!
与郑州天顺合作的

大致流程

合作的大致流程

全国统一服务热线

15003810456
立即咨询