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重组人源超氧化物歧化酶研究进展(一)

来源:郑州天顺食品添加剂有限公司 发布时间:2021-09-12 09:09:25 关注: 0 次
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金属氧化物歧化酶是小动物、绿色植物和微生物菌种中存在的一类酶,是微生物抗氧化性体系的第一道防线,也是身体唯一可以非特异消除自由基的抗氧化酶。SOD为金属酶,按其相结合的金属离子类型不一样,现阶段已发现的SOD关键分成三类,即Cu/Zn-SOD(SOD1)、Mn-SOD(SOD2)和Fe-SOD(SOD3)。身体內外源化学物质在多种水解作用下能造成自由基,自由基在SOD的催化反应下转换为双氧水,身体的过氧化氢酶(CAT)和乳酸脱氢酶(POD)会立刻将其溶解为彻底无毒的水(图1)。当生物沒有非常多的SOD时,臭氧可能很多积累,如无法立即清理便会引起空气氧化损害,造成 人体危害,例如碱基基因突变、DNA解链、膜脂过氧化物和蛋白损害等,进而加速衰老或造成 病症。除开抗氧化性功效外,SOD还具备抗感染、抗癌及管控免疫力等主要功效,而且在免疫力防御力中起杀掉病毒的作用。SOD具备普遍的诊疗使用价值,临床医学上可以用SOD医治和防止炎症反应和浮肿、氧中毒、肺炎、辐射病、老年白內障及变老等。除此之外,SOD还能够当作食品类和护肤品的添加物。

海外关键从羊牛等生物的血液循环系统中获取SOD,中国关键从猪的血液循环系统中获取SOD。小动物來源的SOD存有和人互相污染、过敏反映等安全隐患。除此之外,由于疯牛病等发病因素的散播,从小动物血夜中获取SOD的安全遭受比较严重提出质疑。欧盟国家于1999年已严禁将小动物來源的SOD用以人们诊疗和健康保健。但由于从小动物血夜中获取SOD低成本、加工工艺简易,迄今没法明文禁止。纯天然SOD在使用领域有其局限:①药物半衰期短(5~10min),新陈代谢快速;②异源性—因为纯天然SOD的中药制剂多来自小动物或微生物菌种,对身体而言存有抗原性难题;③不容易穴位敷贴或透膜,消化吸收艰难。纯天然SOD归属于生物大分子蛋白质,在细胞结构上沒有专一蛋白激酶,无法快速进到组织细胞内充分发挥。很多年来大家一直持续试着多种办法来获得SOD并更新改造其构造和特性,进而扩展其使用范畴。常见的办法有化学修饰法、SOD仿真模拟化学物质和基因工程技术法等,在其中根据基因工程技术技术性获得和更新改造SOD的有关科学研究发展趋势尤其快速。1983年,Sherman等初次复制获得人源Cu/Zn-SOD(hCu/Zn-SOD)的cDNA序列,为根据基因工程技术获得和更新改造SOD确立了基本。近些年,专家根据基因工程技术技术性,并融合细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物菌种工程项目等技术性,大大的推进了资产重组SOD在制药方面的运用。现阶段,基因工程技术在工业生产SOD中的位置越来越关键,与化学修饰法和SOD仿真模拟化学物质方式对比,基因工程技术扩张酶源,发展潜力极大,是减少SOD产品成本和得到无抗原性人源SOD的重要途径。

现阶段,有关SOD的具体描述有很多,学者们各自从SOD的来源于、归类、作用和催化机理等领域开展了汇总,并例举了SOD在医药学、农牧业、护肤品和食品类开发设计等领域的运用现状以及市场前景。文中关键具体描述了重组人源SOD的分析对策与进度,以求为SOD的研究与具体运用给予参照。

一、表述系统软件的挑选

挑选适宜的体现系统软件是决策重组人源SOD高效率表述的主要要素(表1)。在挑选基因表达系统软件时,必须考量的首要要素是蛋白质活力、可溶、提取率及塑造周期时间等。

1、大肠埃希菌表述系统软件

在各种各样表述系统软件中,最开始进行科学研究的是大肠埃希菌表述系统软件,它也是现在最完善的体现系统软件。大肠埃希菌表述系统软件具备基因遗传环境清晰、表述量高、繁育快、低成本、可靠性好、抗污实力强和物质非常容易提纯等优势。张弘浩等将人源SOD遗传基因导进大肠埃希菌,获得包涵体方式的重组蛋白,历经尿素溶液解决、分析,重组蛋白由包涵体转换为可溶蛋白质。科学研究强调Cu2 、Zn2 的添加针对修复SOD的活力和可靠性是不可或缺的,且适度提升溫度将大大缩短复性時间,得到的重组人源SOD比魅力可做到6000U/mg之上。Zhu等复制了人源胞外超氧化物歧化酶的cDNA,并在大肠埃希菌中完成了资产重组表述,获得包涵体方式的重组蛋白。根据尿素溶液解决得到可溶蛋白质,并根据固定化酶金属材料亲和层析柱对资产重组hEC-SOD开展逐渐复性,获得了恰当伸缩的二聚体蛋白质和单个蛋白质,二种蛋白质的比魅力各自为3475U/mg和510U/mg,二聚体的活力显著高过单个。

大肠埃希菌表述系统软件虽然有很多优势,但存有蛋白质不可以恰当伸缩、易产生包涵体、密码子管理体系与真核生物区别很大、汉语翻译后装饰不健全和类毒素等运用短板。

2、酵母菌表述系统软件

酵母菌表述系统软件可高质量表述蛋白质,并具备汉语翻译后装饰作用,兼顾原核与真核表述系统软件的优势,因而在基因工程技术行业中获得日益普遍的运用。在其中工业甲醇酵母菌表述系统软件是当前使用最普遍的酵母菌表述系统软件,并以毕赤酵母运用数最多。酿酒酵母代谢外源性蛋白质高效率低,且规模性发醇时造成的酒精会危害菌体本身生长发育,因而无法开展密度高的发醇。林士森等将hEC-SOD在毕赤酵母中表述,从上清液中得到重组蛋白,经提纯后测出重组蛋白的比魅力为1700U/mg。郑屹峰等以表述hCu/Zn-SOD的资产重组毕赤酵母为考虑菌种,选用工业甲醇-凡士林混和喂养的办法开展5L发酵设备密度高的发醇塑造,最后得到的资产重组hCu/Zn-SOD比魅力做到13539U/ml。毕赤酵母表述管理体系表述的重组蛋白可以立即代谢至胞外,故有益于现代化分离出来与提纯,其表示的蛋白质可以产生二硫键、开展糖基化装饰等,且表述量高。殊不知,毕赤酵母表述管理体系存在的不足取决于应用工业甲醇做为诱导剂,具备一定伤害,且糖基化与哺乳类动物体细胞各有不同。

3、绿色植物表述系统软件

绿色植物表述系统软件可以表述来源于病毒感染、病菌和小动物等的蛋白质,便于规模性塑造与生产制造,在基因的表达及装饰层面也是有与众不同的优点。现阶段已在香烟、稻谷、紅花和土豆等绿色植物中完成了很多外源性蛋白质的表述。因为香烟具备微生物生产量高、转换简易、不进到食物网及院内感染风险性小等优点,因而成为了现在进步最完善的绿色植物表述管理体系。Park等根据绿色植物瞬间表述系统软件在香烟叶体细胞中表示出具备催化作用的资产重组hEC-SOD,为绿色植物表述系统软件生产制造资产重组SOD打开了新的大门口。但因为运用绿色植物表述生产制造外源性蛋白质有关工艺发展比较晚,一部分技术性并不是尤其完善,因而现阶段运用绿色植物系统软件生产制造目地蛋白质与其它系统软件对比尚不具有竞争能力。

3、虫类体细胞表述系统软件

二十世纪八十年代起,以杆状病毒为媒介的外源基因表述管理体系日趋完善,巨大推动了虫类体细胞表述系统软件的发展趋势。虫类体细胞表述系统软件既能表述原核遗传基因也可以表述真核遗传基因,并兼顾了原核表述系统软件生产量高和真核表述系统软件蛋白质汉语翻译后装饰的优势。虫类体细胞表达载体选用了虫类异倍体多脚虫体病毒感染中多脚虫体蛋白质遗传基因的强启动子,能够完成许多 真核蛋白的合理表述。常见的靶细胞则来自草地贪夜蛾的Sf-9和Sf-21细胞系。范立强等将hEC-SOD遗传基因插进虫类杆状病毒肾源质粒pFastBacHTb中,再将其转染粉纹夜蛾体细胞Tn-5B1-4,SDS-PAGE和Westernblot数据显示hEC-SOD在粉纹夜蛾体细胞中取得成功表述,其体细胞裂解物中的hEC-SOD比魅力为260U/mg。Shrestha等将总长和裁短的hEC-SOD遗传基因各自复制到肾源质粒pFastBacHTb,并转染到SF9杆状病毒表述系统软件,也取得成功表述出了有活力的总长和裁短的hEC-SOD,且Westernblot表明资产重组hEC-SOD与此同时以单个(33kD)和二聚体(66kD)方式存有。

虫类体细胞表述系统软件能够与此同时表述多个外源基因,在生产制造蛋白质复合体时特别是在合理。现阶段,虫类表述系统软件早已普遍使用于疫苗生产和资产重组病毒感染灭虫剂等很多行业。但因为鳞翅类害虫的蛋白质生产加工途径和高真核生物不一样,且杆状病毒感柒很有可能对寄主的蛋白质生产加工具备不良影响,因而其使用还具有一定的限定。

5、哺乳类动物体细胞表述系统软件

一般通过质粒转染或病毒载体感柒的办法在哺乳类动物体细胞中表述外源性蛋白质。运用病毒感染表述管理体系能够迅速感柒体细胞,在两天内使外源基因融合到病毒载体中,而运用质粒转染得到平稳的转染体细胞则需用几个星期乃至好多个月時间。Lu等选用编号hCu/Zn-SOD和hEC-SOD的2个编码序列,及其奶羊β-opo结构脂的5'端和3'端管控元器件,搭建了甲状腺非特异表达载体,根据共转染法制取奶羊试管胚胎纤维细胞做为供细胞,Westernblot检验表明资产重组hCu/Zn-SOD和hEC-SOD在转双遗传基因奶羊甲状腺中都有表述。协同酶联免疫吸咐实验(ELISA)表明,资产重组hCu/Zn-SOD的表述量为100.14mg/L,资产重组hEC-SOD的表述量为279.10mg/L。酶促反应测量数据显示,鲜羊奶中资产重组hCu/Zn-SOD和hEC-SOD的总生物活性为1451U/ml。这种結果证实了哺乳类动物体细胞具备生产制造资产重组SOD的发展潜力。

申明:文中常用照片、文本来源于《中国食品添加剂》,著作权归原作全部。

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