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Copine-3-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白在细胞中的表达和定位(二)

来源:郑州天顺食品添加剂有限公司 发布时间:2021-09-12 09:05:34 关注: 0 次
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2.9 免疫力机构化学检测:

组织芯片经脱腊凝固、消灭内源过氧化氢酶、热抗原修复和BSA封闭式后,Copine-3抗原1∶500稀释液后滴边加个集成ic,4℃孵育留宿。按GTVisionⅢ型免疫力组织化学诊断试剂盒表明实际操作,滴入HRP标识的高聚物(抗兔/鼠)室内温度孵育40 min,DAB着色2 min,苏木素复染5 min,饮用水清洗10 min返蓝,硫酸酒精分裂10 s,脱干全透明后封片显微镜下查验。

結果

1.体细胞总RNA获取及CPNE3基因扩增

如图所示1所显示,应用总RNA获取检测试剂盒获取HBE的总RNA,经1%琼脂糖电泳电泳原理,数据显示,3条RNA杂带比较清楚、详细,沒有显著弥漫、溶解状况,说明获取的RNA品质不错。

应用任意引物设计将总RNA反转录为c DNA。以c DNA为模版,运用生成的CPNE3遗传基因非特异引物设计开展PCR扩增。PCR物质经1%琼脂糖电泳电泳原理,发生与预估相对分子质量尺寸一致的杂带(约1600 bp)。

2.重组质粒p EGFP-N1-CPNE3的搭建及评定

重组质粒p EGFP-N1-CPNE3经XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切后,经1%琼脂糖电泳电泳原理后,在其中1条精彩片段(约1600 bp)与目的基因尺寸一致,另1条精彩片段(约5000 bp)与p EGFP-N1质粒双酶切后尺寸一致(图2)。

对重组质粒开展DNA测序,結果经分子伴侣序列比对搜索器(basic local alignment search tool,BLAST)核对,插进精彩片段与目地遗传基因编码序列一致。说明取得成功搭建了重组质粒p EGFP-N1-CPNE3。

3.莹光倒置显微镜观查

转染体细胞48 h后,于莹光倒置显微镜下观查,各自转染p EGFP-N1质粒的对照实验和p EGFP-N1-CPNE3重组质粒的对照组体细胞均有翠绿色莹光。说明质粒转染体细胞取得成功并表述EGFP(图3)。

4.激光器扫描仪共焦显微镜观查

p EGFP-N1质粒转染的293T和H1299体细胞中,EGFP在人体细胞内表述遍布匀称;重组质粒p EGFP-N1-CPNE3转染的体细胞,在激光器扫描仪共焦显微镜下能够观测到,翠绿色的Copine-3-EGFP与鲜红色的GAPDH,及其深蓝色的DAPI均有重叠,说明Copine-3-EGFP融合蛋白定坐落于细胞核和细胞质(图4)。

5.显微镜观查

各自搜集一切正常塑造的293T和H1299体细胞,按流程2.7实际操作,在添加抽提实验试剂B解决前后左右各自抽样经结晶体紫上色后显微镜下观查。添加抽提实验试剂B前,细胞膜的结构详细,可观查到完全的体细胞;添加抽提实验试剂B后,细胞质在低渗透浓度标准下澎涨裂开,详细的细胞质被提取(图5)。说明该办法适用胞质蛋白质和胞核蛋白的分离出来。

6. Western blotting检验Copine-3基因表达

各自获取转染p EGFP-N1-CPNE3重组质粒的293T和H1299体细胞的胞质蛋白质和细胞质胞核蛋白,开展Western blotting检验。骨架蛋白β-actin和组蛋白Histon H一分别在胞质蛋白质和胞核蛋白中被检验到;在胞质蛋白质和胞核蛋白中都检验到Copine-3蛋白质。说明Copine-3蛋白质在细胞核和细胞质中都有表述(图6)。

7.免疫力组织化学观查

对肺癌机构临床医学试品开展免疫力机构化学检测,結果如图所示7,箭头符号所显示,细胞核和细胞质中都有深棕色着色,Copine-3蛋白质定坐落于体细胞质和细胞质。

申明:文中常用照片、文本来源于《解剖学报》,著作权归原作全部。

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