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牡蛎中产广谱细菌素芽孢杆菌的筛选及鉴定(一)

来源:郑州天顺食品添加剂有限公司 发布时间:2021-09-12 09:04:05 关注: 0 次
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食源性病原菌的破坏和繁衍是严重危害食品卫生安全和公共健康的要素之一,变成大家重视的热点话题。依据世卫组织全新的数据统计,全世界每一年有近十分之一的人因食品类环境污染而生病,近42万人丧生于食源性疾病。食用添加剂做为增加食品类货架期的一种方式,能够抑止食源性病原菌的生长发育,殊不知食用添加剂潜在性伤害及添加物量变成顾客担心的难题。与此同时,抗菌素做为关键抑止食源性疾病的根源药品,其长期性乱用造成 食源性病原菌的耐药难题越来越比较严重。鉴于此,科学研究工作人员持续找寻纯天然的添加剂及其不容易造成耐药的纯天然抑菌化学物质做为食用添加剂及抗菌素的代替品。

病菌素是病菌核糖体内生成的一类具备抗菌活力的活性多肽或蛋白质类化合物,关键对亲缘关系较近的细菌有一定的抑制效果。病菌素具备高效率、无毒性、可靠性强、没有残留及其不容易形成耐药性等优势,被广泛认为是抗菌素及有机化学防腐剂的替代品之一。现阶段真真正正用以商业化的的乳酸菌饮料病菌素仅有乳酸菌链球菌感染素(nisin)和片革兰阴性杆菌素(pediocinPA1)。导致这个情况的因素主要是乳酸菌饮料病菌素的特性(如有一些乳酸菌饮料病菌素抗菌谱窄、pH敏感度及耐热性差)和分离纯化方式等众多要素限定了乳酸菌饮料病菌素的获得以及工业生产。挑选具备广谱性杀菌作用,pH承受覆盖面广,耐热性好的新式病菌素对食品卫生安全具备关键实际意义。

枯草芽孢菌(Bacillussp.)做为动物与植物和微生态制剂的优点菌,不但类型多种多样、可靠性强,并且普遍出现于大自然中。由枯草芽孢菌中蕨类枯草芽孢菌(B.licheniformis)、枯草枯草芽孢菌(B.subtilis)、凝固枯草芽孢菌(B.coagulans)等造成的病菌素也逐渐被关心和发觉。本分析从福建霞浦水域的杜蛎中分离出来出不一样的病菌,并以普遍的食源性病原菌:橙黄色链球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样枯草芽孢菌(B.cereus)、副血溶弧菌(Vibrioparahemolyticus)等为指示菌,系统软件挑选具备广谱性杀菌作用的产病菌素的病菌。在其中分离出来出具备广谱性抗菌活力的14株病菌经16srDNA遗传基因评定为枯草芽孢菌。这种枯草芽孢菌生产的病菌素主要是由核糖体生成,并具备耐热性和酶敏感度等特性。融合Tricine-SDS-PAGE电泳原理实验效果及LC-MS/MS评定,潜在性病菌素的分子结构质量范围及相应的氨基酸序列均表明以上广谱性病菌素很有可能未被发现。本研究发现的新式广谱性病菌素期待为病菌素的综合利用以及在食品质量安全方面的使用给予数据资料。

1 原材料与方式

1.1 试品

杜蛎产于福建霞浦水域,试品置放于-18℃运到试验室预留。

1.2.1 实验设备

超低温恒温培养箱(MIR-153),日本三洋(SANYO)电动机企业;立柱式工作压力灭菌设备(YXQ-LS-50SII),上海博迅实业公司有限责任公司诊疗机械厂;水准电泳槽及显像系统软件,英国Bio-rad公司;净化工作台(SEX-TJ),上海市整新电子产品;天平秤YP200N,上海市菁海仪器设备有限责任公司;PCR仪(2720ThermalCycler),英国Thermo企业;试品解决仪(MPFastprep-24),英国MP企业。

1.2.2 关键实验试剂

琼脂粉,上海市蓝季生物技术有限责任公司;凡士林、琼脂糖,均购于国药集团;基因DNA获取检测试剂盒、DNAMaker、4sGreen无毒性核酸染料、PCR引物设计,上海市生工生物技术性有限责任公司;Taq酶、ddH2O,上海市拜力生物技术有限责任公司;脑心土壤溶液(BrainHeartInfusion,BHI)培养液、乳酸菌饮料培养液(MRS),美国OXIOD企业。

1.2.3 标示菌种

此次测试的标示菌种均由中国水产科学院南海水产品研究室储存,需要的指示菌及塑造标准等见表1。

1.3 实验方式

1.3.1 试品解决

无菌检测情况下,称量10g牡蛎肉剪下来碾磨,加上到配有90mL盐水的试样解决袋里,将试品在CPU中匀质搅拌2min,用盐水梯度方向稀释液至10-4预留。

1.3.2 菌种分离出来与塑造

选用稀释液涂布平板法对病菌开展单菌体分离出来。各自从10-3、10-42个稀释液度的封闭液中汲取100μL试品液于BHI培养液上,匀称施胶后放置30℃标准下留宿塑造。长出菌体后,无菌检测情况下选择单菌体,注射于5mLBHI液体培养基中,放置30℃标准下留宿塑造。

1.3.3 产病菌素菌种的挑选

1.3.3.1 初筛

选用琼脂粉点种法开展病菌素初筛实验。将100μL留宿塑造的指示菌加上到5mLBHI培养液(含0.8%的琼脂粉)中,倒进BHI培养液(含2.5%的琼脂粉)上,匀称铺平。待其降温凝结而且干躁后,汲取2μL指标值菌开展点样,放置30℃标准下留宿塑造。塑造完成后,在培养液上发生光亮抑菌圈的则觉得有抗菌活力,能抑止相对应的指示菌。对有抗菌活力的菌种在摩尔分数13%的凡士林中储存,放置-20℃储存预留。

1.3.3.2 病菌素对热和酶的稳定性测试

1)病菌素的耐热性实验:将留宿塑造的指标值菌液在10000r/min标准下离心式5min。将上清液在开水中置放15min,随后冰面制冷5min。汲取3μL加温后的上清液,开展琼脂粉点种法开展抗菌,没经热处理工艺的上清液做为对比。

2)病菌素对酶的稳定性测试:将指标值菌留宿塑造,汲取2μL菌液,选用琼脂粉点种法开展抗菌实验;在点过指标值菌部位的边沿,点上1μL浓度值为20μg/mL的胰蛋白酶K,30℃标准下留宿塑造。没经胰蛋白酶K解决的菌液做为对比。

1.3.4 产病菌素菌种的归类评定

1.3.4.1 形状特点

参考参考文献开展菌种形状特点评定。将菌种注射于BHI平板电脑,37℃留宿塑造,观查每个平板电脑菌体形状,选用革兰氏染色法观查病菌形状。

1.3.4.2 菌种基因DNA获取,PCR扩增和菌种评定

对具备抗菌实际效果的指标值菌,按生工Ezup立柱式病菌基因DNA抽提检测试剂盒(上海生工)给予的操作方法获取其DNA。以指示菌基因DNA做为PCR扩增的模版,选用通用引物15F和12R(表2)开展PCR扩增。PCR反映管理体系(50μL):TaqPCRMasterMix(2x,bluedye)(上海生工)25μL,上游引物(10μmol/L)2μL,中下游引物设计(10μmol/L)2μL,基因DNA模版2μL,双蒸水19μL。增加反映情况为:94℃预转性4min;进到PCR循环系统环节后,94℃转性30s,55℃淬火30s,72℃拓宽30s,共30个循环系统;72℃拓宽10min,4℃储存。PCR物质经1.5%的琼脂糖电泳电泳原理后在UV灯下观查到增加杂带后将未纯化的PCR物质送至生工生物工程项目(上海市)股权有限责任公司开展菌种鉴定。转录组测序結果得到的基因序列根据在NCBI的Blast检索系统数据库查询中开展BLAST序列比对。

申明:文中常用照片、文本来源于《中国食品学报》,著作权归原作全部。

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