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维氏气单胞菌中介导的群体感应现象及大蒜提取物的干扰作用(一)

来源:郑州天顺食品添加剂有限公司 发布时间:2021-09-12 09:00:58 关注: 0 次
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微生物菌种的发育繁育和排泄是造成 食品类腐坏变味的主要要素。病菌人群磁感应(QuorumSenSIng,QS)是一种取决于体细胞相对密度的数据沟通方法,以自诱发物(AuToInducerS,AIS)为人群磁感应信号分子,它根据管控食品类中优点腐坏菌的成长新陈代谢来管控食品类腐坏过程。研究表明,人群磁感应缓聚剂可根据与AIS受体蛋白融合,溶解AIS分子结构和阻隔人群磁感应通道等方式合理影响病菌人群磁感应的表述,减少食源性病菌的高致病或致腐性。运用人群磁感应缓聚剂靶向治疗管控病菌的人群磁感应系统软件来抑止食品类腐坏,已变成食品保鲜行业的科研热门之一。

近些年,科学研究专家在新鲜水果、蔬菜水果和中药材等植物提取的提取液中挑选到许多 安全性、合理的活力成份,这种化学物质做为人群磁感应缓聚剂可合理减少微生物菌种的毒副作用。大蒜提取物是具备人群磁感应抑止活力的化学物质,能在亚抗菌浓度值下阻隔N-酰基高丝氨酸内酯(AHLS)信号分子受体的人群磁感应系统软件,抑止其感病因素造成,殊不知,现阶段有关大蒜提取物对腐坏菌腐坏工作能力的影响功效仍难得少有报导。

本实验以在发醇鱼浆中挑选到的腐坏菌维氏气单胞菌为目标,剖析其AHLS受体的人群磁感应状况,研究大蒜提取物对该病菌产AHLS活力、生物膜系统产生工作能力、感病基因的表达和致腐工作能力的影响功效,以求运用大蒜提取物等人群磁感应缓聚剂做为食品保鲜剂,提升 食物的安全系数和货架期。

1 原材料与方式

1.1 原材料与实验试剂

原材料:新鮮蒜头,购于杭州潮王路农贸市场;鱼浆,A级海产品铜盆鱼糜,由上虞市傣之味食品类有限责任公司给予,储藏于-18℃冰柜中,预留。菌苗:维氏气单胞菌,分离出来于发醇鱼浆,加上20%凡士林,储存于本试验室-80℃冰柜中。根癌农杆菌[AgrobActeriumtumefAeiensA136(PcF218/PcF372)],壮观霉素抵抗性,使用量为50μg/mL。

实验试剂:苯甲酸、乙酸丁酯、二甲基亚砜(DmSO)、二甲苯为分析纯级,国药控股化学药品有限责任公司;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、结晶紫、吖啶橙、壮观霉素、病菌基因DnA迅速抽提检测试剂盒、病菌总RnA迅速抽提检测试剂盒,生工生物工程项目(上海市)股权有限责任公司;RP-c18F254S正相反薄层层析板,法国merck企业;AHLS标准物质,英国SIgma企业。
1.2仪器设备与机器设备

SPecTramaxm5酶标仪,英国molecularDevIceS企业;LIFeEcoPcR仪,杭州市博日高新科技有限责任公司;FV300激光共聚焦光学显微镜,日本OLYmPUS企业;STePOne型荧光定量PcR仪,英国ABI企业;PHS-3c型数显式酸度计,上海精科仪器设备有限责任公司;K9840全自动凯氏定氮仪,济南市海能仪器设备股权有限责任公司;e2695型高效率液相色谱,英国WaTerS企业;YXQ-LS-SⅡ立柱式工作压力蒸汽灭菌锅,上海博迅实业公司有限责任公司诊疗机械厂。

1.3 实验方式

1.3.1 病菌产AHLS分子结构检验

参考Ravn等的方式 ,选用微生物汇报菌分析法病菌产AHLS分子结构的活力和类型。

选用平行面划线法剖析AHLS的发生状况,在含1%琼脂粉的LB平板电脑上施胶40μLX-gal(20mg/mL),将活性12h的根癌农杆菌与待测菌平行面画线,于30℃中塑造24h,观查根癌农杆菌的色泽转变 。

将待测菌细胞培养液离心式(8000×g,5mIn,4℃),上清液用相等碱化乙酸丁酯(0.5%苯甲酸)获取2~3次,合拼有机相,旋转蒸发器蒸干有机溶剂,用DmSO再次融解,于-20℃储存备用。

选用平板电脑蔓延分析法AHLS活力转变 ,100mL含1%琼脂粉的LB培养基中添加4~10mL活性的根癌农杆菌和500μLX-gal(20mg/mL),混和匀称后竭尽平板电脑,待制冷凝结后开洞,添加40μL待测菌AHLS萃取液,于30℃中塑造36~48h,观查平板电脑的色泽转变 。

选用薄层色谱法(TLc)剖析病菌造成AHLS类型,取1~10μLAHLS标准物质与病菌AHLS提取液试品,点样于c18正相反薄层层析板。用层析液工业甲醇-水(容积比60/40)充足进行,取下后在常温状态挥干有机溶剂。制取含根癌农杆菌的固体培养基,倾于板上,凝结后在30℃无菌检测密闭式玻璃容器中塑造36~48h,观查顏色转变 。AHLS标准物质的浓度值分別为:0.1mmol/LN-丁酰基-高丝氨酸内酯(c4-HSL)、10μmol/LN-己酰基-高丝氨酸内酯(c6-HSL)、0.04μmol/LN-庚酰基-高丝氨酸内酯(c7-HSL)、0.06μmol/LN-辛酰基-高丝氨酸内酯(c8-HSL)、0.8nmol/L3-氧代-己酰基-高丝氨酸内酯(oxo-c6-HSL)和1.6nmol/L3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯(oxo-c8-HSL)。

1.3.2 病菌的生长曲线及细胞培养液PH值的测量

将活性12h的待测菌注射到100mLLB液体培养基中,在30℃下摇床塑造24h,间距一定時间抽样,参考GB/T4789.2-2008《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》记数,与此同时运用酸度计测量细胞培养液PH值的转变。

1.3.3 遗传基因剖析

选用PcR技术指标分析病菌的luxRI同源基因、鸟氨酸脱羧酶遗传基因(ODC)、磷酸氢钙脱羧酶遗传基因(LDC)、微绒毛遗传基因(flA)、延展性胰蛋白酶(AhyB)、丝氨酸胰蛋白酶遗传基因(ser)、淀粉酶遗传基因(liP)。将病菌留宿活性,运用病菌DnA获取检测试剂盒获取病菌DnA模版,应用的引物设计见表1。50μL反映管理体系,PcR增加程序流程为:预转性95℃3mIn,转性95℃30S,淬火55℃1mIn,拓宽72℃1mIn(3五个循环系统),终拓宽72℃10mIn。在其中,增加AhyB和flA遗传基因时退火工艺为59℃。将扩增到的基因片段开展1%琼脂糖电泳电泳原理,在紫外线下显像,与此同时送到生工生物工程项目有限责任公司转录组测序。将获得的队列开展BLAST检索和开放阅读框剖析。

1.3.4 大蒜提取物的制取

参考RaSmuSSen等的办法制取大蒜提取物。将市面上蒜头削皮,称量150g于300mL二甲苯中匀浆,提纯12h完用WhaTman2号过滤纸过虑。向渗沥液中添加150mL无菌水,在常温情况下拌和24h,两相分离得水相,经0.22μm滤纸过虑后得1g/mL大蒜提取物。根据二倍稀释液法明确大蒜提取物看待测菌的最少抗菌浓度值。

1.3.5 β-半乳糖酶促反应的测量

将待测菌留宿活性12h,取500μL病菌细胞培养液注射至100mLLB液体培养基中,各自添加1mL不一样浓度值的大蒜提取物(终浓度值为0.15~1.20mg/mL),以无菌检测盐水为对比,于30℃摇床中震荡塑造12h,将细胞培养液离心式(8000×g,10mIn)得上清液。参考mIller的办法测量微生物汇报菌的β-半乳糖酶促反应。

申明:文中常用照片、文本来源于《中国食品报》,著作权归原作全部。

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