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油茶叶提取物的5α-还原酶抑制活性及化学成分分析(一)

来源:郑州天顺食品添加剂有限公司 发布时间:2021-09-12 09:00:30 关注: 0 次
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5α-还原酶(5α-Reductase,5α-R)是至关重要的雄激素新陈代谢酶,睾酮素(Testosterone,T)在5α-还原酶(5α-R)的效果下不可逆地转换双氢睾酮(Dihydrotestosterone,DHT),全过程中还需要依靠氧化性辅酶II(NADPH),如图所示1所显示。DHT是最強的活力雄激素,因为它与雄激素蛋白激酶(Androgenreceptor,AR)的中和作用比T高2~5倍,诱发AR数据信号传递的效果比T高10倍可引起雄激素依赖感病症例如痘痘、雄性激素原性掉发、女士多毛症、前列腺肿瘤、前列腺增大、假两性畸形等。

5α-R是肌肤中最重要的雄激素新陈代谢酶,它具备三种同工酶,在其中I型和II型酶的特点非常清楚,二者的关键差异为5α-RI关键出现于肝部及非男性生殖器官肌肤,其充分发挥生理学功效的适宜pH为范畴较宽为6~9,而5α-RII关键存有男性前列腺、男性睾丸、附睾囊肿、精囊腺、头皮毛囊等,其适宜pH为5.5。

现阶段已研发的5α-R缓聚剂包含甾类类和非甾体类,最常用药品如非那雄胺片、度他雄胺、爱普列特等。但这类药品存有副作用,如象征性药品非那雄胺片很有可能对男人导致,抑郁症、焦虑情绪、认知功能障碍、勃起功能障碍、性欲低下、男士乳房女人化、肌肉生长损伤等不良反应,通称为非那雄胺片后综合症(Post-finasteridesyndrome,PFS)。

这种不良反应是这类药自身具有的,无法根据更新改造构造来清除,因而从纯植物中找寻安全性、合理且来源于普遍的5α-R缓聚剂取代这种有机合成的缓聚剂己变成 世界各国科研的网络热点。Niederprüm等根据体外实验确认了锯叶棕果子提取液具备5α-R抑止活力及其医治前列腺增大的实际效果。WeisserH等发觉锯叶棕提取液IDS89对人会男性前列腺上皮细胞和质间中的5α-R具备抑制效果,且归属于非竞争抑止,相关成分是可皂脚亚成分中的月桂酸,它对上皮细胞和基本材料的较大 抑制率分別为52%和45%。邓桂球等从雌虫大白鼠肝部、男性大白鼠附睾囊肿机构中各自获取I型、Ⅱ型5α-R,选用HPLC测定方法出紅花提取液对I型、Ⅱ型5α-R活力均有控制实际效果,抑制率各自做到88.12%和61.65%。此外也是有科学研究报导黄连非州臀果树、大荨麻、熏衣草、莲子芯等绿色植物的提取液具备优良的5α-R抑止活力,是纯天然來源的5α-R缓聚剂。

油荼叶是山茶科绿色植物油茶树CamelliaOleifera的叶,《中华本草》中提及其味有点苦,性温,有医治鼻衄,皮肤溃烂发痒,疮疽的作用。罗晓伟等早已证实油茶树蒲具备5α-R抑止活力,油荼叶与油茶树蒲同是油茶树的关键构成部分,推断油荼叶与油茶树蒲很有可能具备相似的生物活性。文中以5α-R为科学研究靶标,致力于研究油荼叶提取液对5α-R活力的危害,讨论其变成潜在性的5α-R缓聚剂的概率,并剖析其成分,为其在医治雄激素依存性病症如痘痘、前列腺肿瘤等给予理论来源。

1原材料与方式

1.1原材料与仪器设备

新鮮采收的油荼叶,浙江江山市河山中间生物技术有限责任公司给予;SPF等级男性大白鼠4只,休重(200±20)g,由浙江医学科学院给予,许可证号SCXK(浙)2019-0002;还原型辅酶II,Bradford蛋白质浓度值测定试剂盒,上海市碧云天;度他雄胺、睾酮素、没食子酸、芦丁剖析标准品,上海市阿拉丁;色谱仪级工业甲醇等有机化学实验试剂均来源于国药控股化学药品有限责任公司。

高效率液相色谱仪Waterse2695,英国Waters企业沃特世;LunaC18(2)离子交换柱(4.6mm×250mm,5μm),英国Phenomenex企业;UltimateUHPLCLP-C18色谱柱(2.1mm×150mm,1.8μm),上海市月旭;AcquityTMUltra型超高效率液相色谱,英国Waters企业;SciexTripleTOF5600 四级杆航行時间质谱仪器,英国ABSciex企业。

1.2实验方法

1.2.1粗酶提取液的制取及其5α-R成分的测量

参照张蓓的办法并稍加改动,取男性大白鼠4只,忌食禁不住水留宿后脱位处决。快速取肝部,脱离脂肪细胞,秤重,剪下来,放置量杯,添加急冷的提酶缓冲溶液(提酶缓冲溶液:0.32mol/L绵白糖;0.1mmol/LDTT;1mmol/LEDTA;20mmol/L聚磷酸盐缓冲溶液pH7.4)依照1:4(w/v)的占比在冰水浴选用匀浆器匀浆,做成匀浆体,随后将其散装至离心管架,在4℃、10,000×g标准下离心式20min,去除悬浮的人体脂肪,取顶层液态,一样情况下再离心式1h,上清液即是微粒体粗提取液。选用Bradford法对粗酶提取液定量分析,因其总蛋白质含量表明5α-R的成分。

1.2.25α-R酶促反应管理体系的确立与5α-R活力测量

1.2.2.1T标曲的制取

配置系列产品浓度值T水溶液:5μmol/L~2000μmol/L,将差异浓度值T水溶液用0.22μm微孔滤膜过虑至高效液相瓶,进到高效率液相色谱检验,以峰总面积A(AU*min)为纵轴,以T浓度值C(μmol/L)为横坐标轴,制作标曲。

液相色谱仪标准:

离子交换柱:LunaC18(2)柱(4.6mm×250mm,5μm)不锈钢板柱;柱温:30℃;流动性相:工业甲醇/水70/30(V/V);流动速度:1.0mL/min;检验光波长:242nm;气相容积:20μL。

1.2.2.25α-R酶促反应管理体系的创建

在1000μL测活管理体系中,将300μLPBS缓冲溶液(pH7.4)、500μL粗酶提取液封闭液、50μLT、50μL50%酒精、100μLNADPH按序添先后加至离心管架,于漩涡混和仪迅速混和匀称3s,37℃恒温水浴锅反映30min,在t0时刻与t30时刻迅速各自抽样400μL,迅速添加800μL工业甲醇(工业甲醇具有降解胰蛋白酶的功效),涡流5s停止反映。以上反映液在12,000r/min离心式15min,除蛋白质,取上清液,0.22μm有机相滤纸过虑至高效液相瓶,待检验。

1.2.2.35α-R活力测量

HPLC检验较为反映前t0时刻与反映后t30时刻T峰总面积的转变,液相色谱仪标准同1.2.2.1。将T峰总面积带到T标曲,测算出相对应浓度值,及其T浓度值的变化量,进而完成测量5α-R的活力。设定不一样的反映管包含:空白试验管(酶提取液用工业甲醇降解)、酶一切正常反映管、阳性对照管(50%酒精换为度他河北雄安水溶液)。

计算方法如下所示:

△T(μmol/L)=Ct0–Ct30(1)

Ct0表明0min时T浓度值,Ct30表明30min时T浓度值,△T表明反映前后左右T浓度值的误差。

5α-R活力(μmolT/gprot·30min)=(Ct0–Ct30)/C5α-R(2)

界定5α-R活力(μmolT/gprot·30min)为1克酶提取液每30min转换T的量,C5α-R(g/L)表明5α-R粗提取液的浓度值,即5α-R粗提取液蛋白的浓度值。

1.2.35α-R酶促反应管理体系的提升

1.2.3.1反映系统中NADPH、T、粗酶提取液适合加上浓度值的明确

将NADPH用PBS配置成一系列梯度方向:0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L,选用1.2.2中提及的5α-R活力测定法,在固定不动5α-R提取液浓度值为0.76mg/mL、T浓度值为1mmol/L的标准下,以5α-R活力为指标值,调查NADPH的适合加上浓度值。

将T配置成一系列梯度方向:0.025mmol/L、0.1mmol/L、0.4mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L,选用1.2.2中提及的5α-R活力测定法,在固定不动5α-R提取液浓度值为0.76mg/mL,NADPH浓度值为2mmol/L的标准下,以5α-R活力为指标值,调查T的适合加上浓度值。

以蛋白浓度值表明粗酶提取液的浓度值,将其用PBS(pH7.4)缓冲溶液稀释液成系列产品梯度方向:0.38mg/mL、0.76mg/mL、1.52mg/mL、3.03mg/mL、6.06mg/mL,选用1.2.2中提及的5α-R活力测定法,在固定不动T浓度值为2mmol/L,NADPH浓度值为2mmol/L的标准下,以5α-R活力为指标值,调查粗酶提取液的适合加上浓度值。

1.2.3.2反映管理体系可靠性的调查

明确最后反映管理体系每个成分的浓度值标准:76mg/mL粗酶提取液500μL,2mmol/LT50μL,试品50μL,2mmol/LNADPH100μL,各自测量四次空白试验管和酶一切正常反映管的T浓度值转变,调查反映机制的反复性和可靠性,测算相对偏差RSD。

1.2.3.3度他雄胺5α-R抑止活力的测量

度他雄胺是Ⅰ型5α-R缓聚剂,将其为呈阳性药品并稀释液成系列产品梯度方向:2nmol/L、4nmol/L、6nmol/L、8nmol/L、12nmol/L、16nmol/L,选用1.2.2中提及的5α-R活力测定法,在合适的NADPH浓度值、T浓度值、粗酶提取液浓度值情况下,把50%乙醇溶液换成系列产品浓度值的度他雄胺水溶液,调查不一样浓度值度他雄胺对5α-R活力的抑制率,制作抑止曲线图,测算出度他雄胺对5α-R活力的半抑止浓度值(IC50),公式计算如下所示:

申明:文中常用照片、文本来源于《食品工业科技》,著作权归原作全部。

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