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两种甜叶菊废渣提取物对D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用(一)

来源:郑州天顺食品添加剂有限公司 发布时间:2021-09-10 09:32:42 关注: 0 次
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甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)属多年生长 菊科木本植物,原产地于非洲地区和墨西哥的高山草甸,尤其是南美洲巴拉圭东北部地区。甜叶菊中含有甜菊糖苷,被普遍作为纯天然甜味素。有科学研究报导从甜菊提取液中评定出89种化学物质,并将其划分为多酚类、三萜类、碳水化合物化合物、油酸以及化合物类、低聚木糖、糖脂质、漂呤和维甲酸等。这种化学物质具备各种生物活性,如抗氧化性,抗菌,抗癌等。甜菊提取液中的花青素和黄酮类化合物、多糖类化学物质具备较强的身体之外降低胆固醇的工作能力。殊不知,有关甜叶菊提取液身体抗氧化性活力的科学研究很少有报导。在生产制造甜菊糖苷的环节中会形成很多的斜板沉淀池废料,在其中富含大量的的多酚类,而这种副产品并未获得灵活运用。科学研究甜叶菊废料提取液的抗氧化性、延缓衰老功效,对充足综合利用甜叶菊資源有着关键实际意义。

本探讨选用高效液相色谱色谱分析(HPLC)对二种甜叶菊废料提取液中的主要成分开展定性分析,并检测其对D-半乳糖致变老小白鼠血清蛋白、肝部和脑部中一些主要的抗氧化性指标值(如超氧化物歧化酶(SOD)、硫辛酸乳酸脱氢酶(GPx)和丙二醛(MDA),及其脑部中Nrf2以及靶遗传基因(SOD1,GPx1,HO-1)的mRNA表述能力的危害等,讨论甜叶菊废料提取液对D-半乳糖致变老小白鼠的抗氧化性功效,为其进一步开发设计和使用给予理论来源。

一、原材料与方式

1、实验原材料

二种甜叶菊废料提取液,晨光生物高新科技控股集团有限责任公司。

2、动物实验

SPF级昆明市种男性小白鼠(33~37g,SPF级,8周龄),军事医学科学院动物实验核心,小动物合格证书号:SCXK-(军)2012-0004。

3、关键实验试剂

D-半乳糖(分析纯级),国药控股化学药品有限责任公司;茶氨酸(茶氨酸>88%、EGCG>40%、儿茶酸=0.76%),成都市华高生物制药有限责任公司;咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、原儿茶醛、槲皮苷(纯净度均≧98%),成都市瑞芬斯生物技术有限责任公司;超氧化物歧化酶(SOD)、硫辛酸乳酸脱氢酶(GPx)、丙二醛(MDA)测定试剂盒,南京建成生物技术研究室;BCA法蛋白定量检测试剂盒、高纯度总RNA迅速获取检测试剂盒(离心式柱形),北京市百泰克生物科技有限责任公司;FastQuantcDNA第一链生成检测试剂盒(去基因),天根生化高新科技(北京市)有限责任公司;工业甲醇(色谱仪级),北京市迈瑞达高新科技有限责任公司;其他实验试剂均为国内分析纯级。

4、仪器设备与机器设备

Agilent1290超高效率液相色谱仪,英国安捷伦科技有限责任公司;DY89Ⅱ匀浆机,宁波新芝生物技术有限责任公司;SpectraMax13持续光波长多用途酶标仪,英国MolecularDevices企业;3K15台式离心机,法国Sigma企业;S1000PCR扩增仪、CFX96荧光定量PCR仪,英国伯乐相马企业;NanoDropTM2000少量紫外线-能见光光度计,英国赛默飞世尔企业。

5、实验方式

(1)二种甜叶菊废料提取液中主要成分的定性分析

本试验室分析工作人员早期科学研究确认,甜叶菊废料提取液的主要成分为咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、原儿茶醛和槲皮苷。选用HPLC法对二种甜叶菊废料提取液中的主要成分开展定性分析。高效率液相色谱仪标准为:AgilentEclipsePlusC18色谱柱(50mm×2.1mm,1.8μm),流动性相为0.1%苯甲酸(A)和工业甲醇(B),流动速度0.1mL/min。过柱程序流程:0~10min,10%~50%(B);10~12min,50%~10%(B);12~15min,10%(B)。检验光波长320nm和360nm,柱温30℃,进样量1μL。选用咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、原儿茶醛和槲皮苷为标准物质,按以上色谱仪标准各自测量。以标准物质的质量摩尔浓度为横坐标轴,峰总面积为纵轴,制作HPLC标曲,并测量二种甜叶菊废料提取液中各主要成分的成分。

(2)甜叶菊废料提取液对D-半乳糖致变老小白鼠的抗氧化性功效

①小白鼠喂养标准

小白鼠喂养于北京食用添加剂工程设计研究所,自然通风标准优良,一切正常白天黑夜转变(9:00-21:00),空气湿度(40±5)%,室内温度(21±2)℃。

②试验排序及实际操作

80只试验小白鼠融入7d,喂养一般精饲料,随意饮用水、寻食。稳定期后,任意等分成一切正常组、D-半乳糖组、二种甜叶菊废料提取液低、中、高使用量组(各自灌胃100,200,500mg/kgbw甜叶菊废料提取液),每一组10只,与此同时用苦味酸对小白鼠开展序号。每组在灌胃的与此同时,D-半乳糖组和甜叶菊废料提取液组,颈后背皮内注射5%的D-半乳糖水溶液(500mg/kgbw),一切正常组注入等大小的盐水。每日给药1次,延迟时间为11周。

③被测样版制取

试验完成后,小白鼠忌食(禁不住水)11h。11h后,小白鼠摘目光采血,全血搜集于整洁的1.5mL离心管架中,37℃水浴15min,4000×g离心式15min分离出来血清蛋白,-80℃储存被测。取血后,将小白鼠断颈处决并解剖学,取下肝部和脑部并将其在急冷的盐水中浸洗,除去血夜,用过滤纸吸走表层水份。将肝部和脑部一部分放进小离心管架里,马上放进液态氮(-196℃)中冷冻,转到超低温冰箱(-80℃)储放,预留。另一部分剪下来,添加9倍0.9%急冷的盐水,置夹层玻璃匀浆器中冰水浴快速碾磨做成机构匀浆,4℃,12000×g离心式15min,取上清液,-80℃储存预留。

④血清蛋白及机构抗氧化性指标值的测量

测量血清蛋白、肝和脑部匀浆中SOD,GPx魅力及MDA成分,检验方式 具体步骤按检测试剂盒表明开展。

⑤莹光定量PCR检验小白鼠脑mRNA表述水准

选用高纯度总RNA迅速获取检测试剂盒获取每组小白鼠脑部中总RNA,应用NanoDropTM2000少量紫外线-能见光光度计检验其一致性以及浓度值。按逆转录检测试剂盒操作指南,将获取的RNA逆转录成cDNA并放置-20℃储存。根据SYBRGreen法开展荧光定量,反映管理体系以下(20μL):无RNA酶水7.4μL,SuperRealPreMixPlus(SYBRGreen)10μL,上中下游引物设计各0.8μL,cDNA模版1μL。RT-PCR反映标准:94℃预转性3min,94℃转性30s,60℃淬火30s,72℃拓宽1min,40个循环系统。以β-actin为内参基因开展即时莹光定量PCR剖析。计算方式选用较为CT值法。涉及到的引物设计编码序列见表1。

(3)数据信息数据分析

选用SPSS20.0统计分析软件,实验数据信息以平均值±相对标准偏差(Mean±SD)表明,用单要素方差分析(one-wayANOVA)及多重比较(Duncan)开展差别显著性分析,P<0.05为差别明显。

申明:文中常用照片、文本来源于《中国食品添加剂》,著作权归原作全部。

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